使用稳定生产细胞系，在灌流生物反应器中，高效生产rAAV

重组腺相关病毒(rAAV)目前在大约250个基因治疗临床试验中被用作载体。尽管如此，在生产工艺中仍然存在一些挑战。由于生产平台的限制，如生产规模和活细胞密度，rAAV的产量往往不足以满足之后的市场需求。

利用CEVEC ELEVECTA®平台的专利稳定生产细胞，在灌流模式下进行工艺强化，成功解决了这一挑战。该平台由人悬浮细胞组成，稳定整合了产生AAV所需的所有成分：腺病毒辅助功能、AAV复制酶和衣壳基因、以及目的基因(GOI)。该系统的生产通过强力霉素诱导。通过概念验证克隆的含GFP（GOI）AAV8载体的生产，证明了这种方法的性能。

近年来，灌流生物工艺因其不同的应用模式而变得更加流行。灌流模式指细胞截留在生物反应器中的连续工艺，其可使细胞密度更高，并有利于用新鲜培养基置换营养成分已经耗竭的培养基，从而降低生物反应器内副产物的浓度。本实验所采用的灌流装置由一个连接了ATF-2系统的实验室规模搅拌罐生物反应器组成。在以批次模式进行的细胞生长阶段结束后，开始灌流，使细胞生长到高密度。当达到目标活细胞密度时，诱导生产AAV，并在生产阶段保持灌流模式(图1)。在诱导后5天，从回流液中收获细胞悬液。

图1：在搅拌罐生物反应器中培养ELEVECTA®生产细胞系以稳定生产rAAV。基于ATF的灌流工艺与传统批次工艺的比较。活细胞密度(VCD)和活性。分别进行2次灌流模式和2次批次模式的独立运行。在ATF灌流工艺中，接种3天后开始灌流，7天后诱导产生rAAV (虚线)。在批次生产工艺中，接种3天后诱导生产rAAV(虚线)。

基于灌流的生产工艺可获得高病毒基因组(10¹⁵ vg/L)和衣壳滴度(图2-A)。与批次模式(n=2)中的对照工艺相比，灌流模式(n=2)中 qPCR测定的AAV单位体积产量高出40倍 (n=2)，且诱导时的VCD高出5倍。灌流模式中的细胞特异性产率(vg/cell)提高了8倍。值得注意的是，完全稳定AAV生产细胞系的灌流工艺也获得了高百分比的完整颗粒(高30 - 40%)(图2-B)。

图2：灌流模式中rAAV (细胞悬液样品)的生产情况，显示诱导后的不同时间点。A) qPCR检测AAV8基因组滴度。ELISA检测衣壳滴度。B)完整衣壳的百分比(基因组滴度与衣壳滴度的比率)。

考虑到ATF系统和生物反应器的可放大性，在灌流中使用稳定、无辅助病毒系统的方法，为大规模生产高滴度、高质量的rAAV提供了独特的潜力。

本文内容编译自以下原文，由于水平有限，不足之处，敬请谅解。详细内容，请参考原文。

原文：J.Coronel, A.Patil, A.Al-Dali, et al., Efficient Production of rAAV in a Perfusion Bioreactor Using an ELEVECTA® Stable Producer Cell Line. Genetic Engineering & Biotechnology News, 2021.

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